Regroupement des étudiants chercheurs en pharmacologie
de l'Université de Sherbrooke

Il est parfois nécessaire de quantifier le signal des bandes obtenues à partir de différents types de gels ou d’autoradiogrammes. Le moyen le plus simple d’y parvenir est par densitométrie, c’est-à-dire par la mesure de l’intensité et de la quantité du signal généré. Pour se faire, il n’est pas nécessaire d’avoir un équipement très sophistiqué et onéreux ; seuls un numériseur et un logiciel disponible gratuitement sont nécessaires. Cet article montrera comment procéder avec le logiciel ImageJ.

ImageJ

ImageJ est un logiciel libre qui est disponible à la fois pour Windows, Mac OS et Linux. Le logiciel est développé par le National Institutes of Health (NIH) et est adapté pour analyser différents types d’images scientifiques tels que celles obtenues en microscopie ou par numérisation d’autoradiogrammes et de gels. Il est possible de le télécharger sur cette page.

Numérisation de l’image

La première étape est la numérisation du gel ou encore du film. Pour ce faire, un numériseur domestique fait très bien l’affaire. Dans le cas où l’on a affaire à un gel ou un film transparent, de meilleurs résultats sont obtenus en mode numérisation de transparents (couleurs positives).

Durant l’acquisition de l’image, il faut faire attention de ne pas modifier inutilement l’équilibre des couleurs. Le meilleur moyen pour y parvenir est de désactiver tous les filtres d’amélioration de l’image qui peuvent changer considérablement l’aspect de nos bandes durant la numérisation. Parfois, ces filtres permettent d’améliorer le contraste des images et peuvent, pour ce faire, changer la valeur de certains points de l’image dans le but de les rendre plus visibles. Ces filtres font donc varier le rapport entre les points les plus foncés et les plus pâles de l’image et affecteront directement la qualité de la quantification.

Analyse par ImageJ

Avant de commencer, assurez-vous que les bandes de votre gel sont les plus droites possible sur l’image à analyser, ça vous facilitera grandement la tâche pour les sélectionner durant la quantification . Vous pouvez faire une rotation de vos images dans des logiciels tels que Photoshop, Gimp et bien sûr ImageJ. Une fois que votre image est prête, ouvrez la avec ImageJ. Pour commencer, repérer le menu Analyse -> Gels qui contient la plupart des fonctions que vous utiliserez (figure 1)

Figure 1

Le menu utile pour la quantification de gels.

Figure 2

Sélection des bandes.

Ensuite, avec l’outil de sélection par rectangles (le premier à gauche) faites un rectangle autour de votre bande qui se trouve dans la première piste. Ensuite faites Analyse -> Gels -> Select first Lane. Faites de même avec les autres pistes, mais cette fois avec la commande Analyse -> Gels -> Select Next Lane. Vous devriez vous retrouver avec quelque chose de semblable à la figure 2. Notez que vous pouvez déplacer toujours le même rectangle en cliquant d’abord sur son centre et en le déplaçant par la suite. Avant de continuer, allez dans le menu Analyse -> Gels -> Gel Analyser Options et configurer les options comme à la figure 3.

Figure 3

Configuration de base.

Figure 4

Graphique de l’intensité des bandes.

Maintenant, pour quantifier vos bandes, faites Analyse -> Gels -> Plot lanes. Vous devriez voir un graphique quantifiant vos bandes comme le montre la figure 4. Le tracé est la somme des points (axe vertical) de l’image selon l’emplacement sur l’image (axe horizontal). Chacun des pics correspond donc à une bande. Avec l’outil de lignes, vous pouvez tracer une ligne sous chacun des pics pour indiquer à quelle valeur se trouve le bruit de fond (figure 5). Ensuite, avec la baguette magique, sélectionnez chacun des pics en partant de la gauche. En se faisant, vous devriez voir apparaître une nouvelle fenêtre avec les résultats de votre analyse (aire sous la courbe et pourcentage). En fait, pour obtenir le pourcentage, il faut sélectionner Gels -> Label Peaks qui numérotera, du même coup, les pics.

Figure 5

Sélection des bandes.

Figure 6

Une autre méthode.

Vous auriez également pu procéder, comme le montre la figure 6, en utilisant seulement un rectangle pour les trois bandes. Vous remarquerez que les résultats ne sont pas exactement les mêmes avec les deux méthodes. Ceci est principalement dû au traitement du bruit de fond. À vous de juger quelle est la meilleure méthode selon votre image et la distribution du bruit de fond.